식물조직배양및實驗
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작성일 23-07-11 16:30
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세포벽을 군데군데 무너뜨리는 물질은 EDTA이며, 이때 sucrose나 glucose가 첨가되어 세포의 형태를 유지하도록 하는데 lysozyme을 쓰기도 한다. SDS라는 detergent가 세포막을 녹여버리면서 안에 있던 세포 내용물이 용액으로 흘러나오게 되는데 이때 alkali 용액에 노출된 DNA 는 모두 denature 되지만 크기가 작은 supercoiled plasmid DNA는 그다지 심각하게 되지 않는 성질을 이용하는 것이다.
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Ⅳ. 올바른 clone 선택
1) Plasmid DNA 분리
주로 miniprep이라고 부르는 이 방법은 plasmid DNA를 소량 분리하는 방법으로 가장 보편적으로 사용되는 방법인 Alkali lysis method이다. 이 때 세포막은 유지되도록 한다.기본원리는 세균의 cell wall과 cell membrane을 부수고 DNA만을 분리하는 것으로 이 때 중요한 것은 세균이 원래 가지고 있는 chromosomal DNA와 plasmid DNA를 구분하여 분리하는 것인데 이 둘은 모두 DNA이므로 성질이 비슷하기 때문에 구분하여 분리하기가 쉽지 않다. 다행히 chromosomal DNA는 분리 과정에서 linear 형태가 되고 크기가 상당히 크기 때문에 이런 성질의 차이를 이용하면 분리할 수 있다
※ Alkali lysis method 의 원리
① 세포벽을 깬다.
② 세포막을 조심스럽게 깨서 크기가 큰 chromosomal DNA가 너무 잘게 조각나는 것을 방지하면서 용액에 DNA를 노출시킨다.
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③ pH를 급격히 7.0까지 복구시키면 크기가 작고 supercoiled form을 유지하고 있던 plasmid는 비교적 renaturation이 잘 되지만, chromosomal DNA는 미처 renature되지 못하고 엉기게 되는데 이렇게 엉긴 chromosomal DNA를 원심분리로 제거한다. 그러면
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